科学证实您手中的（精油）可能对肝癌有用

肝癌是发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，具有发病年龄轻、恶性程度高、起病隐匿、进展快等特点。目前肝癌治疗手段主要包括手术、化疗和放疗等，但手术切除不 彻底、复发率和转移率高是影响肝癌临床治疗疗效的主要问题，其治疗的总体疗效仍不理想。而天然抗肿瘤药物因具有疗效显著、副作用小、作用独特与研究成本低的特点逐渐广泛应用于临床治疗。

连香树（Cercidiphyllum japonicum）又名山白果、云义树和五君树，是连香树科连香树 属的一种古老落叶高大乔木。主要分布于日本和我国山西南部、四川西部与东南部等海拔 400~2 500 m 的常绿和落叶阔叶混交林中。连香树果实主要治疗小儿的惊风抽搐肢冷等症 状；树皮煎水后饮服，对感冒、痢疾等疾病具有特殊疗效；其甲醇提取物能抑制蔬菜病原菌的活性。虽然连香树拥有较高药用价值，但缺乏对其功效的系统科学研究。目前对连香 树的研究大多数是关于濒危状况、培育繁殖、群落结构、遗传多样性和生态特性等方面，而 针对其次生代谢和功能开发方面研究较少。本实验采用连香树精油处理人肝癌 SMMC-7721 细胞，探究其对该细胞增殖、凋亡与自噬的影响，并检测自噬与凋亡相关蛋白探究其可能的 抗肿瘤机制，进一步为肝细胞癌的治疗提供依据，同时为连香树的开发利用提供理论参考。

科研结果与分析

一、连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖的影响

      连香树精油对 SMMC-7721 细胞增殖的影响结果见图 1，由图 1 可知，精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞有明显抑制作用，且呈剂量依赖性。处理 12、24、48 h 后的 IC50 值分别为 0.108、0.104、0.132 mg/mL，可得出 24 h 处理后 IC50 值为最小，因此选取 24 h 作为后续试 验的处理时间。

二、连香树精油使人肝癌 SMMC-7721 细胞阻滞在 G2 /M 期

      连香树精油对 SMMC-7721 细胞周期的影响如图 2，G0/G1 期的细胞比例由 73.47%下降 到 66.27%；G2/M 期的细胞比例由 7.14%升高至 11.14%，说明此时部分细胞阻滞在 G2/M 期。

三、连香树精油诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞凋亡

3.1 连香树精油对 SMMC-7721 细胞凋亡率的影响 

用流式细胞仪检测连香树精油诱导 SMMC-7721 细胞凋亡率的结果见图 3，随着连香树 精油浓度的升高，细胞凋亡率呈剂量依赖性升高。当处理浓度为 0 mg/mL 时，细胞凋亡率 （早凋+晚凋）为 4.19%；当处理浓度为 0.6 mg/mL 时，细胞凋亡率（早凋+晚凋）为 20.58%。

 AO/EB 染色后 SMMC-7721 细胞凋亡形态结果见图 4，由图 4 可知，随着连香树精油浓 度的升高，绿色荧光的活细胞数目减少，呈桔红色或红色荧光的凋亡细胞数增多。

3.3 连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞线粒体膜电位的影响 

      经 JC-1 法测定连香树精油处理人肝癌 SMMC-7721 细胞后胞内线粒体膜电位的变化情 况结果见表 1，由表 1 可知，随着连香树精油浓度的升高，SMMC-7721 细胞内的膜电位比 值呈剂量依赖性下降。表明连香树精油诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞线粒体膜电位下降。

3.4 连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞 Caspase1,8 的影响 

      连香树精油对凋亡与焦亡相关蛋白的影响如表 2 所示，由表 2 可知，随着连香树精油浓 度的升高，SMMC-7721 细胞内 caspase8 相比对照组无明显上调趋势，Caspase1 相比对照组 先下降后上升但无明显升高趋势，表明连香树精油没有明显通过诱导死亡受体介导的细胞凋 亡和活化 caspase1 介导的细胞焦亡两条途径来诱导细胞死亡。

四、连香树精油诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞自噬

4.1 透色电镜观察自噬体形态 

      透色电镜下自噬体形态如图 5 所示，由图可知，当连香树精油浓度为 0 mg/mL 时，细 胞结构完整，核膜清晰；当连香树精油浓度为 0.3 mg/mL 时，细胞内染色质呈无规律的块状 分布，出现许多明显的双层膜结构或者包裹着需要降解的细胞器的自噬体，说明连香树精油 诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞自噬。

4.2 连香树精油对自噬相关蛋白的影响 

      连香树精油对自噬相关蛋白的影响如图 6 所示，结果表明，随着连香树精油浓度的升高， 细胞中自噬相关蛋白 LC3-Ⅰ逐渐向 LC3-Ⅱ转化，造成 LC3-Ⅱ蛋白的大量积累，Beclin-1 的 蛋白水平明显上调，表明连香树精油诱导了人肝癌 SMMC-7721 细胞发生较高水平的自噬。

五、连香树精油诱导的自噬抑制人肝癌 SMMC-7721 细胞凋亡

      为研究连香树精油诱导SMMC-7721细胞自噬在凋亡中的作用，将自噬抑制剂氯喹和连 香树精油共同孵育SMMC-7721细胞，自噬相关蛋白表达结果如图7所示。由图7可知，LC3-Ⅰ 蛋白积累较多，LC3-Ⅱ蛋白减少，表明自噬受到抑制。抑制连香树精油诱导SMMC-7721细 胞的自噬后，蛋白表达结果如图8所示，Bcl-2抗凋亡蛋白随连香树精油浓度的增大而明显下 调，表明在抑制了连香树精油诱导人肝癌SMMC-7721细胞的自噬后促进了连香树精油对人 肝癌SMMC-7721细胞的凋亡作用。

结论很重要

近年来，植物来源的天然提取物及其次生代谢产物生物活性的研究备受关注[7]，特别是 植物抗肿瘤药物领域发展迅猛。目前已筛选出具有抗肿瘤活性的植物提取物多达 3 万种，应 用于临床的抗肿瘤药物已有 80 多种。具有生理或者药理活性的植物提取物能够通过阻滞 细胞周期，诱导细胞发生凋亡和自噬等方式来抑制并杀死肿瘤细胞。本研究也从这几个方 面研究了连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞的作用情况。

细胞有丝分裂的正常运行对细胞的增殖和生长有着重要的调控作用，阻滞细胞周期导致 细胞周期紊乱已经成为药物作用于肿瘤细胞的新靶点。研究表明，蛇床子通过阻滞 N87 胃癌细胞 G2/M 期从而抑制细胞增殖；SHIP2 同样阻滞喉癌 Hep-2 细胞的 G2/M 期。在 本研究中，连香树精油处理人肝癌SMMC-7721细胞24 h后，细胞中G0/G1期的比例由73.47%下降到 66.27%，G2/M 期的比例由 7.14%升高至 11.14%，推测连香树精油通过将部分人肝癌 SMMC-7721 细胞阻滞在 G2/M 期达到抑制细胞分裂的作用。

细胞凋亡是一个在相关基因调控下进行高度程序化的过程，遵循固有的程序性自杀机 制，细胞发生凋亡时可以形成凋亡小体，最后被邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬。在本实 验中，连香树精油处理人肝癌 SMMC-7721 细胞 24 h 后诱导了肿瘤细胞的凋亡，表现为线 粒体膜电位的下降。细胞外源死亡受体介导的凋亡主要的三条 Fas/FasL、TRAIL 和 TNFR 信号转导通路都需要 caspase8 的活化。本研究中测定了连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细 胞中 caspase8 蛋白的影响，发现 caspase8 蛋白水平相比对照组无显著上调，推测连香树精 油没有通过外源死亡受体途径诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞凋亡。

细胞焦亡是近年来新的一种依赖于炎症小体半胱天冬酶-1（caspase-1）的细胞死亡方式。Wei 等的研究表明半夏凝集素通过激活 MAPKs/NF-κb 通路释放 IL-1β，IL-1β 依赖于 caspase1 发挥促炎作用。本研究中，通过测定连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞中 caspase1 蛋白的水平发现 caspase1 与对照组相比先下调后上升，无明显上调趋势，推测连香 树精油没有诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞焦亡。 

细胞自噬是细胞通过自噬溶酶体途径从而降解细胞内自身物质的过程，与细胞凋亡都属 于细胞程序性死亡。二者间存在紧密的联系，主要表现为：一，自噬和凋亡共同促进细胞 死亡；第二，自噬与凋亡互为拮抗作用，自噬为肿瘤细胞提供生存所须的原料或 ATP，抑制 细胞凋亡；第三，自噬促进细胞向凋亡的转化。Li 等的研究发现药用植物远志中的瓯 黄酮诱导 SKOV3 和 OVCAR3 人卵巢癌细胞发生的自噬抑制了其诱导的凋亡作用；还有研 究表明饥饿诱导 K562/ADM 白血病细胞发生保护性自噬，抑制其凋亡的发生。本研究发 现连香树精油诱导了人肝癌 SMMC-7721 细胞自噬，推测自噬过程抑制了肿瘤细胞的凋亡作用。在加入自噬抑制剂后，Bcl-2 抗凋亡蛋白水平显著下调，促进了 SMMC-7721 细胞的凋亡作用，表明连香树精油处理 SMMC-7721 细胞后诱导的自噬作为一种保护机制存在，二者表现为拮抗作用。可以考虑通过抑制细胞的自噬过程来促进连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞的凋亡作用来杀死肿瘤细胞。 

综上所述，连香树精油对人肝癌 SMMC-7721 细胞具有显著的细胞毒性作用，显著降低 了细胞活力并破坏细胞结构；通过阻滞部分 G2/M 期的细胞影响细胞周期；降低细胞中的线 粒体膜电位诱导 SMMC-7721 细胞发生凋亡。同时连香树精油能够强烈人肝癌 SMMC-7721 细胞发生自噬，而自噬在精油诱导的细胞凋亡中作为一种保护机制存在。

文章原作：四川师范大学生命科学学院

                    李飞，杨添雁，沙秀芬，李群